实时荧光PCR | 内标定量与外标定量的差异
实时荧光PCR:内标定量与外标定量的差异
CACLP体外诊断资讯 2021-11-30 16:49
实时荧光定量PCR中样本的浓度对数值(log 值)与扩增曲线 Ct 值呈线性关系, Ct 值越小,浓度越高。根据所采用的定量数学模型的差别,有外标定量法(外标法)和内标定量法(内标法)两种方法。
外标定量:使用一系列已知浓度外定量标准品(一般4-5个浓度梯度)与待测标本进行测定,通过标准品浓度的 log 值( y )和扩增的 Ct 值( x )间线性比例关系,可得到待测样本浓度值和 Ct 值的关系公式,简单理解即 y=Kx+B ,K 和 B 值需由外标准曲线获取,样本扩增 Ct 值( x )代入公式中即可算出待测样本的浓度值( y )。
内标定量:此处指已知浓度的标准品(即定量内标,1个浓度)与待测样本在同一管内扩增的方法,内标的浓度 log 值(y内)与 Ct内 有一个关系 K1 ,待测样本的浓度 log 值(y样)与扩增 Ct样 也有一个关系 K2 ,通过设计优化使样本和内标扩增效率一致,即 K1 = K2,则样本浓度 y样 可通过内标的浓度 y内 、两个 Ct内 和 Ct样 间的关系计算出,不同厂家 K 的算法模型有差异,相对复杂。
— 两种方法比较 —
_ | 外标法 | 内标法 |
内标作用 | 辅助样本定量 | • 辅助样本定量 • 同时监控核酸提取和扩增有效性 |
扩增效率假设 | 样本=定量标准品 | 样本=内标 |
标准品与样本 是否同管扩增 | 否 | 是 |
孔间提取效率 差异对结果干扰 | 较大 | 低 |
孔间扩增效率 差异对结果 干扰 | 较大 | 低 |
样本定量准确性 | 依赖于样品和标准品扩增效率是否一致,忽略样本的基质差异 | 依赖于反应体系的稳定和算法优化 |
每批实验额外 损耗试剂 | 4-5人份 | 无 |
优势 | • 计算软件设计方便 • 设备系统相对开放 | • 无需额外试剂消耗 • 无需参比荧光校正孔间差,测量更精细 •内标法定量更适用于低通量的分子POCT检测 |
劣势 | • 严格上需每次实验都做标准曲线测定,有额外试剂损耗 • 标本的基质差异,及设备偏差带来的孔间差会降低定量准确度 | • 对试剂开发,设备及监测体系稳定性要求高 • 需要专门的算法和软件判读 |
代表商品化 试剂 | • 雅培Abbott RealTime HBV Assay • 国产多数品牌 HBV DNA和 HCV RNA定量试剂 | • 丽珠HBV DNA、HCV RNA和HIV-1 RNA定量试剂 • 罗氏COBAS TaqMan HBV Test, 2.0 • 赛沛Xpert HCV Viral Load |
总结
内标定量由于开发难度留给了设计者,用户层面结果分析更简单,结果由软件自动判读;因实验无需额外制作标准曲线,每次上机节约4-5人份试剂位,损耗更低,也是未来分子POCT实现定量的最佳方案。
外标定量通过测定一条标准曲线,按统一标准对所有孔样本相对“粗放”地定量,因而更容易适应不同设备系统,设计开发也更简单。两种方法各有优势。
题外话,为防止假阴性,要求每个反应孔中均需设置内标,用于监控样本核酸提取和扩增有效性,此内标在外标法定量体系中,仅作为孔内质控使用,在内标定量体系中,同时兼具定量功能。
参考文献:
[1]李金明. 实时荧光PCR技术 第2版.北京:科学出版社.