DNA聚合酶的保真度检测方法你了解吗？

原理：利用DNA聚合酶扩增lacZ基因，基于lacZ基因的α-互补性，它能还原β-半乳糖苷酶基因活性，并产生蓝色菌落，结合蓝白斑筛选评估保真度。

操作步骤：用DNA聚合酶扩增lacZ基因，将PCR产物连接到载体上，转化，蓝白斑筛选。若lacZ基因存在错误，则破坏β-半乳糖苷酶活性，菌落呈现白色，白斑克隆的比例可转化为错误掺入的数量。

操作步骤：根据DNA模板设计PCR扩增引物；利用DNA聚合酶进行PCR扩增；将PCR产物克隆至载体上，挑取单菌落进行大规模Sanger测序，计算发生错配的核苷酸数与聚合的总核苷酸数的比值（错配率）。

操作步骤：根据DNA模板设计PCR扩增引物；利用DNA聚合酶进行PCR扩增；将PCR产物利用NGS平台对DNA分子进行双向测定，筛选正反两个方向均有效的数据，在突变的判定过程中，正反两个方向均测定出突变的位置记为一次突变，此突变属于DNA聚合酶引入的突变；如测定只有一个方向测定出现突变，另一个方向测定无突变，则该突变为测序平台引入的突变，不属于DNA聚合酶扩增引入的突变，计算DNA聚合酶扩增过程中引入的突变/有效DNA测序量（保真度）[1]。

提示：在PCR扩增中，不同的序列引入突变的概率是有差异的，一般研究人员选择为多个扩增产物进行测序比较，扩增的目的基因序列在设置在容易导入基因突变的富含GC 序列区域以及重复等区域。