一、HPV RNA检测

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus, HPV)是一种小分子的、无被膜包被的环状双链DNA病毒，基因组长约8000bp，分为3个功能区：早期转录区(E区)、晚期转录区(L区)和非转录区(长控制区，LCR)。HPV通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类，不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。

目前已发现HPV有200余种亚型，根据其基因型别致病力或致癌危险性大小可分为低危型和高危型两大类。全球范围的研究结果显示，在99.7%的宫颈癌患者体内，可检测到高危型HPV DNA的存在，其中HPV16型、18型、45型和31型感染占80%。

1. HPV体内复制机制

宫颈癌是常见的女性妇科恶性肿瘤，但并非所有HPV感染者都会发展为癌症患者，大多数感染为自限性，在没有任何长期健康干预时，超过90％的感染女性凭借自身免疫即可清除感染，不会引起任何症状或疾病。而只有持续性的高危型HPV感染才是导致宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要原因。

HPV的３个基因功能区中，早期转录区编码早期蛋白E1、E2、E4、E5、E6和E7，参与调节病毒的生命周期、调控DNA复制、转录和病毒蛋白的翻译等；晚期转录区则编码晚期蛋白L1和L2，即病毒的衣壳蛋白，主要参与细胞表面吸附、病毒颗粒包装及病毒进入细胞质过程；非转录区含有顺式调控单元及病毒复制的起点，负责调控病毒基因的复制和转录。

当HPV进入宿主细胞后，其基因组DNA有两种存在方式，即整合状态和游离状态，其中良性病变中多以游离形式存在，而在恶性肿瘤中则多以整合状态存在。感染高危型HPV后，随着细胞异型程度的加重，高危型病毒基因组发生断裂，诱发病毒序列整合到宿主基因组中，其结合位点多位于E2附近, 致使HPV E2基因对E6、E7基因启动的负向调节作用缺失，使得E6、E7基因表达异常，进而与细胞周期调节因子p53和Rb蛋白结合，导致细胞生长失控，产生致癌作用。期间，HPV E6/E7 mRNA表达水平与病变的严重程度息息相关。

2. E6/E7 mRNA检测意义

(1)在高危型HPV初始感染阶段，HPV E6/E7基因处于静默期，不表达或低表达mRNA，一过性感染大多数处于这个阶段；而当病毒进入持续感染阶段时，HPV E6/E7 mRNA高水平表达，产生癌蛋白，进而逐步发展为癌前病变，直至癌变。因此，E6/E7 mRNA是HPV感染后，宫颈病变开始和和进展的必由之路，是病毒基因活跃状态的关键性标志物。

(2)HPV筛查方法经历了由宫颈涂片到液基细胞学，再到HPV DNA检测的过程，其中HPV DNA检测具有较高灵敏度，但其临床特异性较低，无法判断出宫颈感染的具体阶段以及癌基因的活性程度；HPV E6/E7 mRNA具有与DNA检测相似的灵敏度，而其特异性更高，可作为年轻女性宫颈病变风险的有效筛查手段，减少过度诊治。

3. E6/E7 mRNA检测方法

HPV的检测方法多种多样，是分子诊断行业中竞争态势最为激烈的项目之一。其中HPV核酸检测产品，大多以其基因组DNA作为靶标进行检测。第一个经FDA认证的HPV RNA检测产品，是美国Hologic公司开发的Aptima HPV方法，该方法利用转录介导的扩增技术(Transcription Mediated Amplification, TMA)检测HPV E6/E7 mRNA，有效降低了传统HPV DNA检测对于一过性HPV感染的检出率，识别出了真正存在癌变风险的HPV感染。Hologic的HPV检测产品有两种：Aptima HPV(AHPV)和Aptima HPV16/18/45 Genotype(AHPV GT)，前者可检测14种高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、 59、66和68)，但不作具体分型；后者可区分检测HPV16和HPV18/45，其中HPV18/45无法区分具体型别。

国内开发HPV核酸检测产品的厂家中，既有稳打稳扎的老牌企业，也有敢打敢拼的后起之秀，他们采用了各种不同的技术方法检测HPV核酸，有不分型产品也有分型产品、有定性试剂也有定量试剂。但绝大部分国内获证的产品还是检测HPV DNA，其中郑州科蒂亚生物技术有限公司的产品才检测HPV E6/E7 mRNA，使用的是支链DNA信号扩增法，该方法无需RNA抽提纯化、反转录和扩增等步骤，只需将样本裂解后，经探针杂交与信号放大即可获得基因检测结果。

二、HBV RNA检测

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)是一种长度约为3200bp、有包膜、部分环状的双链嗜肝DNA病毒。其基因组含有4个部分重叠的开放读框（ORF），即前-S/S区、前-C/C 区、P区和X区。其中P区编码聚合酶/逆转录酶，目前已知的核苷（酸）类药物的耐药突变均发生在HBV的P区。HBV虽属于DNA病毒，但其复制需经过以前基因组RNA(pregenomic RNA, pgRNA)为复制中间体的逆转录过程。在此过程中，HBV逆转录酶由于缺乏严格的校正机制，导致HBV复制过程中核苷酸错配率较高，以致于在不同个体中形成具有耐药性的病毒株。

1. HBV体内复制机制

HBV感染呈世界性流行，但不同地区HBV感染的流行强度差异很大。在我国，肝癌发生最常见的原因是感染HBV后引起的慢性乙型肝炎，进而转变为肝硬化、肝衰竭和肝癌。

完整HBV颗粒中包含的松弛环状DNA(relaxed circular DNA, rcDNA)是有部分缺失的双链环状DNA。在HBV侵入肝细胞后，rcDNA将被修复成具有完整双链形态的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)。cccDNA转录形成前基因组RNA(pregenomicRNA, pgRNA)，与具有逆转录活性的HBV DNA聚合酶(p蛋白)结合形成复合物，招募HBcAg聚集形成核衣壳。在核衣壳内，先以pgRNA为模板，p蛋白发挥逆转录酶活性合成病毒的负链DNA，再以负链为模板合成出不完整的正链DNA；继而pgRNA被p蛋白的RNase H酶活性降解，最终含有不完全开链环状rcDNA的核衣壳，经多囊泡小体释放到胞外，形成完整的子代病毒。

研究者在探究HBV感染人外周血单核细胞的过程中，还意外发现，患者血清中存在HBV RNA；进一步的研究证明这些血清中的HBV RNA是存在于核衣壳内的、未完成或部分完成逆转录的前基因组RNA(pgRNA)，且同样含有病毒外膜，被称为“HBV RNA病毒样颗粒”。