EHA105(pSoup)电击转化感受态
EHA105(pSoup) 电转感受态细胞产品简介本品为根癌农杆菌EHA105(pSoup)(基因型:C58 (rifR) Ti pEHA105(pSoup)
产品简介
本品为根癌农杆菌EHA105(pSoup)(基因型:C58 (rifR) Ti pEHA105(pSoup) (pTiBo542DT-DNA) Succinamopine(pSoup-tetR))制作的电击感受态细胞。EHA105(pSoup)菌株由EHA101菌株改造而来,为C58型背景,核基因中含有筛选标签--利福平抗性基因rif,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pEHA105(pTiBo542DT-DNA),此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件,pEHA105(pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏,但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。在EHA105菌株中转入help质粒:pSoup即为EHA105 (pSoup)菌株,可帮助pGreen,62SK,pGs2系列质粒在农杆菌中复制,同时赋予该菌株四环素(tet)抗性。EHA105(pSoup)电转感受态特别适用于大质粒的转化。经pGs2质粒(4445bp,KanR)检测转化效率>105 cfu/μg DNA;经pGs2-ZH质粒(40kb,KanR)检测转化效率>5×103 cfu/μg DNA。
产品规格
品名 | 货号 | 规格 |
EHA105(pSoup)电转化感受态 | EL031H-S | 5×50 μL |
EL031H-M | 10×50 μL |
-80℃(12个月)
转化方法
1. 0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,使乙醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。
2. 取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟,待其融化,加入0.01-1 μg质粒DNA(体积不大于6ul),用手拨打管底混匀,立即插入冰中,用200 μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中,盖上杯盖,空管保留待用。
3. 启动电转仪,根据仪器要求设置参数,将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中,加入900 μl无抗生素的LB并转移到感受态空管中,28℃振荡培养2~3小时。
4. 6000 rpm离心一分钟收菌,留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的平板上,倒置放于28℃培养箱培养2-3天(当平板只含有50 μg/ml kan 时,28℃培养48 h即可;平板中同时加入50 μg/ml kan,20 μg/ml rif 时,需28℃培养60 h;如果使用的平板含有50 μg/ml rif 则需要28℃培养72-90 h)。
注意事项
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化效率急剧下降;质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
2. 混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 平板上阳性克隆密度过大时,由于营养不足,阳性克隆生长变慢,菌落变小,为了获得大的菌落,应减少质粒用量。
4. 利福平浓度不应高于25 μg/ml,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率。
5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失,但链霉素不利于农杆菌的转基因操作,所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素,Ti质粒丢失的概率极低。