LwaCas13a(C2c2)
依赖于crRNA单独介导的RNA内切核酸酶，来源于_Leptotrichia wadei_菌株。可特异地识别并剪切靶标单链RNA，且对PFS序列的要求并不严格。
LwaCas13a(又名C2c2)是依赖于crRNA单独介导的RNA内切核酸酶，来源于_Leptotrichia wadei_菌株。可特异地识别并剪切靶标单链RNA，且对PFS序列的要求并不严格。此外，Cas13a也具有反式剪切活性(即旁路剪切活性/附属剪切活性)，即当LwaCas13a蛋白与crRNA、靶标RNA结合形成三元复合物后，便会被激活针对非特异序列单链RNA的反式剪切活性，将体系中的任意序列单链RNA切碎。该活性可被用于核酸的检测开发。
crRNA/gRNA：与Cas13a 结合，形成功能复合物，被目标序列特异性激活。
LwaCas13a crRNA scaffold sequence 结构序列: 5'-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAA-3'
组分 | E0803H1 (100 pmol) | E0803H3(1,000 pmol) |
LwaCas13a Nuclease (10 μM) | 100 pmol | 1,000 pmol |
10 × LwaCas13a Reaction Buffer | 1 mL | 1 mL |
LwaCas12a Nuclease 1000 pmol规格的浓度为10 μM，即10 pmol/μL，1000 pmol规格的总体积为100 μL
-20℃储存；≤ 0℃运输。
1.LwaCas13a的反式剪切：本实验中包含LwaCas13a、crRNA，以及不同浓度梯度的target RNA，并在剪切反应体系中加入等量的ssRNA报告探针,该探针5′端标记荧光报告基团(FAM)，3′端标记荧光淬灭基团(BHQ1)。实验结果表明，LwaCas13a在crRNA引导下与特异靶标ssRNA形成三元复合物后，便会被激活针对ssRNA的反式剪切活性，剪切体系中的ssRNA报告探针并发出荧光信号。靶标RNA浓度越高，体系反式剪切ssRNA报告探针的速度更快，释放的荧光信号到达平台期的时间越短。
图1:不同浓度梯度ssRNA靶标存在下LwaCas13a的反式剪切结果。
1.反式切割实验
组分 | 体积 | 终浓度 |
10 × LwaCas13a Reaction Buffer< | 2 μL | 1 × |
10 μM LwaCas13a Nuclease | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
10 μM crRNA | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
10 μM Target RNA | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
10 μM ssRNA Reporter (FAM-BHQ1) | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
Nuclease-free water | Up to 20 μL |
◆ 反式剪切体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，LwaCas13a Nuclease可用1 × LwaCas13a Reaction Buffer稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的Cas13酶长期保存，请使用Cas13 Dilution Buffer，crRNA、Target RNA及ssRNA Reporter可用Nuclease-free Water稀释，但极低浓度的Target RNA（例如LOD实验）建议用0.1% Tween
◆ 实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，37℃反应，每30 sec采集一次荧光信号。
LwaCas13a的crRNA可参照以下序列设计：
5′-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3′,（前一部分为direct repeat区，下划线标示crRNA与特异靶标序列互补配对的spacer区，建议spacer区长度为28 nt)。
