m6A环状RNA测序

m6A环状RNA测序

近年来，科学家们发现了一种可逆的RNA甲基化--m6A，即RNA分子腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰（N6-methyladenosine，m6A）。研究发现，m6A是真核生物mRNA上常见的一种转录后修饰， m6A在细胞加速mRNA代谢和翻译，在细胞分化、胚胎发育和压力应答等过程中起重要作用。我们提供 m6A 甲基化免疫沉淀测序（m6A Methylation Immunoprecipitation Sequencing，简称 m6A MeRIP-seq）服务，助力 m6A 修饰研究。目前对m6A RNA流行检测手段为MeRIP-Seq技术，我们提供成熟m6A RNA甲基化MeRIP-seq服务，技术原理如下： 将甲基化RNA特异性抗体与被随机打断的RNA片段进行共孵育，抓取有甲基化修饰的片段进行测序；同时需要平行测序一个对照（Input）样本，对照样本只含有打断的RNA片段，并不添加RNA甲基化特异性抗体与其共孵育。对照样本用于消除非特异性抓取甲基化片段的背景。对比免疫共沉淀(IP)样本和对照样本（Input）中的序列片段，将RNA甲基化修饰位点定位到转录组上，并根据RNA-seq数据，计算样本中RNA甲基化程度。

m6A RNA-seq实验流程 

RNA甲基化测序产品

技术优势

一站式服务

客户只需提供组织、细胞、体液样品或RNA，我们为您完成从m6A RNA-seq富集，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。

优化的实验流程

m6A RNA-seq的富集效率是决定数据质量的关键，我们m6A RNA-seq实验采用预验证的商业化抗体和精心优化的实验流程，具有极高的效率和特异性。

严格的质控

我们对m6A RNA-seq实验每一步骤均设有关键质控，全程监控实验质量，保证客户得到优质数据。

专业的生物信息学分析

我们拥有专业的生物信息分析团队，帮助客户进行实验数据的全面挖掘。

RNA甲基化测序与转录组联合应用

可整合RNA甲基化数据和转录组数据进行生物信息学关联分析，揭示RNA甲基化对基因表达调控的影响，深入挖掘RNA甲基化的功能。

样品要求

样品类型

细胞、组织或RNA，其他样本类型请电询。

样品量

a) 细胞：2×107 

b) 组织：100 mg-1 g

c) RNA：30-300 μg（OD260/280：1.6-2.3；RNA无明显降解28S:18S>1.5或RIN>7）

样品运输与保存

样品运输：样品置于1.5mL离心管中，封口膜封好，干冰运输。

样品保存：细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮冻存后-80℃保存；RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存，避免反复冻融。

数据分析（下列有※表示个性化分析）

1、识别甲基化富集峰

通过高通量测序和生物信息分析，识别（p <10-5）甲基化富集的基因组区域。

注：每个样品组做一个Input，以去除基因组背景，降低假阳性率

2、RNA甲基富集峰注释※

通过生物信息分析利用邻近基因对富集峰进行注释，并根据峰中点相对于已知基因的位置，将富集峰为启动子峰、上游峰、内含子峰、外显子峰、基因间峰。

3、RNA甲基化富集峰区域的在基因组中的分布 ※

根据注释信息，绘制富集峰在不同基因组特征上的比例图。   

4、RNA甲基化位点Motif分析※

RNA上甲基化的位点，可能包含某种序列motif。RNA甲基化酶可能正是通过识别这些 motif特异性进行甲基化修饰，从而完成转录后调控功能。我们成功识别了全基因组的RNA上的甲基化位点后，获取序列就能使用生物信息学的手段来搜索这些 motif，从而揭示RNA甲基化修饰的机制。

5、差异RNA甲基化区域的识别与聚类※

我们使用 diffReps 包进行差异甲基化位点的识别。默认筛选标准为 FDR<=0.05，具体以报告为准。识别样本间的差异甲基化区，发现与特定表型或疾病相关的甲基化区域。

6、差异甲基化区的GO与信号通路分析

对差异甲基化基因进行功能分类，并发现明显富集的功能条目。

7、Reads 的分布※

使用 ngs.plot 工具可以展示匹配 reads 在 TSS， genebody， TES 等位点的分布情况，可以用来观察 RNA 甲基化对 TSS 等位点是否有偏好。

案例解析

案例1：m6A调控环状RNA编码蛋白质

原文：Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine

期刊：Cell Research 影响因子：15.60

这篇文章出自中科院王泽峰团队，证实发生大量的环形RNA可作为mRNA来编码蛋白，这些环形mRNA通过m6A RNA甲基化修饰驱动非帽依赖性的翻译机制来参与蛋白编码过程。该研究进一步拓展了环装RNA的功能，对蛋白质的来源的多样性有新的认识，具有十分重要的理论意义。作者借助RIP测序技术，发现与mRNA相比，m6A甲基化修饰在环状RNA上更普遍。

图1. m6A调控circRNA编码蛋白质机制

案例2：环状RNA普遍存在m6A修饰且呈现细胞特异性

原文：Genome-Wide Maps of m6A circRNAs Identify Widespread and Cell-Type-Specific Methylation Patterns that Are Distinct from mRNAs

期刊：Cell Reports 影响因子：8.03

本文通过高通量测序方法检测到Hela细胞和hESC细胞m6A RNA甲基化谱，发现环状RNA在两类细胞中普遍存在。通过生信分析，对比两种细胞共有及特有的环状RNA并通过验证手段（Sanger测序）验证成环状位置的序列。

图2. Hela细胞和hESC细胞m6A甲基化谱及序列的验证