BJ5183-AD-1电击转化感受态

BJ5183-AD-1 电转感受态细胞

产品简介 

本品为大肠杆菌BJ5183-AD-1（基因型：_end_A1 _sbc_BC _rec_BC _gal_K _met thi_-1 bio_T hsd_R (Str^R) [pAdEasy-1 (Amp^R)]）制作的电击感受态细胞，只能用于电击转化，不能用于热激转化。BJ5183-AD-1是携带了腺病毒质粒pAdEasy-1的BJ5183菌株。BJ5183菌株是一种具有较高重组活力的大肠杆菌菌株，是目前腺病毒系统最常用的感受态细胞。BJ5183菌株含有_sbc_BC _rec_BC双重突变，赋予BJ5183细胞较强的重组能力，有利于转入的目的基因与腺病毒骨架质粒的重组。_end_A1（缺失核酸内切酶）的突变有利于重组DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。BJ5183-AD-1菌株细胞中已经提前转入了腺病毒质粒pAdEasy-1[encodes the Adenovirus-5 genome (E1/E3 deleted)]，赋予该菌株氨苄抗性，在病毒质粒构建时，只需转入线性化的目的质粒即可，简化了实验步骤，提高了病毒质粒重组概率。Str^R 赋予BJ5183-AD-1菌株链霉素抗性。BJ5183-AD-1电击感受态细胞适用于普通质粒和大质粒的构建，经特殊工艺制作，pCAMBIA2301（12739bp，Kan^R）检测转化效率>1×10⁶ cfu/μg DNA。

产品规格

转化方法

1.取适量LB放37度预热1-2小时（每管感受态准备10mlLB）。

2. 0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。

3.取-80℃保存的电击感受态细胞插入冰中5分钟，待其融化，加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。

4.用200 ul枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA 混合物快速移到电击杯中（避免产生气泡），轻轻晃动使液面保持水平状态，盖上杯盖，插入冰中。

5.启动电转仪，根据仪器要求设置参数，将电击杯从冰中拿出，用吸水纸擦拭表面，吸干表面水渍，放入电转槽中，电击完成后拿出电转杯放室温，打开杯盖，15秒内加入100ul预热的LB（此步骤可在电转仪旁操作，无需在超净台操作），用1ml枪吹吸电击杯底部2-3次，混匀后转移到50 ml离心管，向离心管中补加LB培养基至10 ml。37℃，220 rpm 复苏60分钟。

6.5000rpm离心一分钟收菌，留取100-200ul菌液重悬后涂布到含相应抗生素的平板上。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养12-16小时。

注意事项

1.加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。

2.电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。

3. 当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。

4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。

5.若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

6.对于连接产物，最好用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA后用适量ddH2O或TE缓冲液(10 mM Tris HCl, pH7.5;1 mM EDTA)重悬产物，保证DNA浓度不超过100 ng/ul。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。

7. 混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

8. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。