Rosetta-gami B(DE3)化学转化感受态

Rosetta-gami B(DE3) Chemically Competent Cell

产品简介

Rosetta-gami B(DE3) 菌株聚合了 BL21，Tuner，Origami 和 Rosetta 四种菌株的优点：

＊ lacY1 基因 (半乳糖苷透性酶基因)突变赋予其 Tuner 菌株的优点----IPTG 以均一速度进入体系中大肠杆菌的 每个细胞，产生更加严格、均一的浓度依赖。

＊ pRARE 赋予其 Rosetta 菌株的优点----补充大肠杆菌缺乏的 6 种稀有密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)对应的 tRNA，提高外源基因的表达水平。

＊ gor522::Tn10 trxB 赋予其 Origami 菌株的优点----突变的硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase) (trxB)和谷 胱甘肽还原酶(glutathione reductase) (gor)基因，它们是还原途径的两个关键酶，其突变有利于高效形成正确折 叠的含有二硫键的蛋白，增强蛋白的可溶性。

＊ 该菌株染色体整合了 λ 噬菌体 DE3 区 (DE3 区含有 T7 噬菌体 RNA 聚合酶)适合 T7 启动子诱导的蛋白表达。

＊ Rosetta-gamiB(DE3)菌株具有卡那霉素，氯霉素，四环素抗性，由特殊工艺制作，经 pUC19 质粒（2686bp， AmpR）检测转化效率>107 cfu/μg DNA。

产品规格EC1012

Rosetta-gami B(DE3) Competent Cell 100μl /支

pUC19 (control vector, 10ng/μl) 10μl

保存条件（保质期）： -80℃（6 个月） 

 基因型 F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm lacY1 ahpC (DE3) gor522::Tn10 trxB pRARE (CamR, KanR, TetR)

操作方法

1. Rosetta-gamiB(DE3)菌株感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5 分钟后待菌块融化，加入目的质粒，并用 手拨打 EP 管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置 25 分钟。
2. 42℃水浴热激 45 秒，迅速放回冰上并静置 2 分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入 700 μl 不含抗生素的无菌培养基 (2YT 或 LB)，混匀后 37℃，200 rpm 复苏 60 分钟。
4. 5000 rpm 离心一分钟收菌，留取 100 μl 左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含 34 μg/ml 氯霉素及所选质粒筛选 抗生素的 2YT 或 LB 培养基上。
5. 将平板倒置放于 37℃培养箱过夜培养。 ● 蛋白小量诱导表达 Protocol (for reference only)
6. 小摇接菌：在透气试管或透气离心管中准备 1-3ml 含相应抗生素的液体 LB（或 2YT、TB、SB 等营养丰富 培养基），接入一个含有目的质粒的新鲜单菌落。
7. 37℃，200 rpm 过夜摇菌约 10-15h。
8. 大摇接菌：将第一步的小摇菌液按 1-2%比例接菌到 50ml 含相应抗生素的 LB（或 2YT、TB、SB 等营养丰 富培养基），为增加溶氧，最好使用 500ml 三角瓶（加入营养液的体积一般为三角瓶标定体积的 1/10，最 高不超过 1/5）。
9. 37℃，150 rpm 摇菌到 OD600 值为 0.5-0.8（一般需要 2-4h）。
10. 空白对照取样（可选步骤）：在加入诱导剂 IPTG 前可取样 1ml 菌液到 1.5ml 离心管中，12000rpm 离心 10 分钟，弃上清，沉淀放-20℃保存待用。
11. 第四步的三角瓶中加入 IPTG 至终浓度为 1mM（IPTG 浓度可自由调整），继续 37℃，120 rpm 摇菌 2-4h。
12. 不同时间点取样（可选步骤）：最佳摇菌时间与所表达蛋白有关，表达蛋白不同最佳摇菌时间不同，为找到 最佳诱导时间可在不同诱导时间点取样（例：在诱导第 2h，4h，6h，8h，14h 取样，离心后放-20℃保 存）。
13. 离心收菌：三角瓶从摇床拿出，埋入冰中 10 分钟， 4℃，5000g，10 分钟离心，弃上清，沉淀保存在20℃。

14. 待所有样品准备妥当，可以做 SDS-PAGE 分析蛋白表达。

● 1 M IPTG 溶液配制（唯地 CAT#：YC8022）： 2.38 g IPTG 加入无菌的双蒸水 10 mL，完全溶解后用 0.22um 的滤膜过滤除菌。 

● 氯霉素配制（唯地 CAT#：YC9030）： 氯霉素(Chloramphenicol) 100mg/ml 溶于乙醇，完全溶解后用 0.22um 的滤膜过滤除菌；工作浓度：34 μg/ml。

注意事项

1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中 8 分钟内加入目标 DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存 放会降低转化效率。
2. 混入质粒时应轻柔操作，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 诱导时，IPTG 浓度可选（0.1-2 mM 均可）。
4. 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG 浓度需实验者优化。
5. Rosetta-gamiB(DE3)菌株携带 pRARE 质粒，除复苏培养基为无抗生素外，其余所用培养基、培养液均应含 有 34 μg/ml 氯霉素，以防质粒丢失。

6. 具有卡那霉素抗性，不能用于具有卡那霉素抗性质粒的表达。